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ISSN 0582-9879                                          ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(9): 816-822                                    CN 31-1300/Q

 

Researching a Novel NPC-related Candidate Suppressor Gene BRD7 by Two-dimensional Gel Electrophoresis and MALDI-TOF-MS

PENG Cong, LIANG Song-Ping1, TAN Chen, LV Hong-Bin, HUANG He, ZHOU Min, WANG Rong, LI Xiao-Lin, LI Gui-Yuan

( Cancer Research Institute, Xiangya Medical college, Central South University, Changsha 410078；1College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410078, China )

 

Abstract        BRD7 was isolated through cDNA representational difference analysis (RDA) ( GenBank accession No. AF152604). Previous studies showed that BRD7 gene was down-regulated in nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells and tissues, and three cSNPs (coding-region single nucleotide polymorphisms) were found on BRD7. In addition, six BRD7-interacting proteins were identified by yeast two-hybrid system. To study the function of this gene on carcinogenesis in NPC, BRD7 gene was transfected into HNE1 cells low-expressed BRD7 by using liposomes and a stable cell line over-expressing BRD7 was established. After two-dimensional gel electrophoresis(2-DE), twenty differentially expressed proteins were identified by MALDI-TOF-MS including argininosuccinate lyase, metalloproteinase inhibitor-2 precursor, proteaseome activator28 beta subunit, thyroid transcriptional factor-1, cyclinH (MO15-associated protein), and so on. These differentially expressed proteins are related to cell cycling, transcription regulation, signaling pathway etc. Therefore, BRD7 may exert its functions by mediating differential expression of these proteins.

 

Key words     Nasopharyngeal carcinoma； BRD7 gene； gene transfection； two-dimensional gel electrophoresis (2-DE)； MAIDL-TOF-MS

 

运用蛋白质组学技术研究鼻咽癌候选抑瘤基因BRD7

彭聪    梁宋平1   谭琛    吕红斌     黄河    周鸣    王蓉    李小玲*    李桂源

（1军事医学科学院放射医学研究所, 北京 100850;2军事医学科学院卫生学与环境医学研究所, 天津 300050 ）

 

摘要       BRD7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆得到的一个新基因(GenBank 登录号AF152604)。 初步研究显示， 它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调， 并且能部分逆转其恶性表型。 在BRD7基因的编码区发现了3个cSNP， 并且采用酵母双杂交系统筛选出6种与BRD7蛋白相互作用的蛋白质。 为进一步研究其可能的作用机制， 通过脂质体转染方法， 将BRD7基因导入NPC细胞株HNE1细胞中， 采用蛋白质组技术研究该基因对鼻咽癌蛋白质表达谱的影响， 从而考察该基因在肿瘤发生发展中的地位和作用。 通过对过表达BRD7基因后鼻咽癌细胞系HNE1的蛋白质表达谱改变的研究， 鉴定出20个差异表达蛋白质， 这些蛋白质包括精氨酸代琥珀酸裂解酶(argininosuccinate Lyase)、 金属蛋白酶抑制因子2前体(Metalloproteinase inhibitor-2 precursor)、 蛋白酶体激活因子28β亚单位(Proteaseome activator28 β subunit)、 甲状腺转录因子1(thyroid transcriptional factor-1)、 细胞周期蛋白H(cyclinH， MO15-associated protein)等。 这些差异蛋白质涉及基因表达调控、 细胞周期的调控分子、 细胞免疫、 细胞代谢等众多事件。

 

关键词   鼻咽癌； BRD7基因； 基因转染； 双向电泳； MAIDL-TOF-MS

 

鼻咽癌（nasophargngeal, carcinoma, NPC）在世界大多数国家极罕见， 在我国南方与东南亚地区相对高发， 尤其以湖南、 广东、 广西、 福建最为突出。 流行病学研究显示， 鼻咽癌的发病有明显的地域和种族差异， 另外， 10%的鼻咽癌患者有癌家族史。 鼻咽癌病因学研究证实， 鼻咽癌的发生与EB病毒、 遗传易感性及某些环境理化因素有关[1～3]。 分子遗传学研究表明鼻咽癌基因组在3p、 9p、 7q3、 11q等区域存在高频率等位基因的杂合性丢失（Loss of heterozygosity,LOH）。 这些结果提示鼻咽癌的遗传不稳定性可能与这些区域存在遗传易感基因或抑瘤基因有关。

BRD7基因是我室通过cDNA代表性差异分析(cDNA RDA)从鼻咽癌组织中克隆的一个表达下调差异基因（GenBank登录号AF152604）。 初步研究显示该基因能部分逆转鼻咽癌细胞株HNE1的恶性表型， 并且发现两个SNP位点[4]。 通过酵母双杂交技术筛选到与BRD7蛋白相互作用的蛋白[5]BRD3、 BRD2 、 β-IkB 激酶、 KIAA1375、 IL-7和接头相关蛋白复合物3 δ-1亚单位(adaptor-related protein complex 3, delta 1 subunit)。 其中β-IkB 激酶参与HPK1-MEKK1信号转导通路,而IL-7是前B细胞活化因子。 说明BRD7基因很可能是一个潜在的鼻咽癌的抑瘤基因。

蛋白质组最先是由澳大利亚科学家Wilkins和Williams在1994年提出来的， 最早见诸于1995年7月的《Electrophoresis》杂志。 我室从1999年开始了该项研究， 并取得了进展[6－10]。 本研究采用转基因技术构建过表达BRD7基因鼻咽癌细胞株HNE1， 运用双向电泳和质谱研究过表达BRD7鼻咽癌细胞株HNE1后蛋白质表达谱的改变， 通过对差异蛋白质点的鉴定与分析， 探索BRD7对鼻咽癌细胞株蛋白质表达谱的影响， 从而了解该基因在鼻咽癌发生发展中的地位与作用。

 

1   材料和方法(Materials and Methods)
1.1 材料

1.1.1      低分化鳞状上皮鼻咽癌细胞系HNE1     为肿瘤研究所建

1.1.2      pcDNA3.1(+)/BRD7载体    pcDNA3.1(+)载体为哺乳动物高效表达载体， 为Invitrogen公司的产品。 pcDNA3.1(+)/BRD7载体由我室自己构建。

1.1.3      试剂盒   随机引物标记盒、 反转录试剂盒、 PCR产物纯化试剂盒购自美国Promega公司， trizolTM试剂购自美国gibcol/BRL公司。 同位素α-[32P]-dCTP， 购自北京福瑞公司。

1.1.4      引物       引物由大连宝生物有限公司合成。 左引物为5′-cgt gga tcc gaa gaa gta gaa cag aca-3′， 右引物为5′-att ccc ggg gaa tta ttt cct ggc taa-3′。

1.1.5      蛋白质组研究所用试剂     固相pH梯度干胶条（pH 3～10 L， 18 cm）等购自Pharmacia公司产品； 丙烯酰胺（acrylamide）、 亚甲基双丙烯酰胺（Bis）、 银染试剂为国产分析纯； 乙腈（ACN）为国产色谱纯； 其他试剂为国产分析纯试剂。
1.1.6      仪器       PGphor 电泳单元及双向电泳附件、 等电聚焦系统、 IPGPhor 电泳系统购自Pharmacia公司; 垂直平板电泳系统、 循环水浴箱、 PDQuest 2-D胶分析系统为Bio-Rad 公司。

 

1.2 方法

1.2.1      pcDNA3.1(+)/BRD7/HNE1稳定表达系的建立 在6孔板中， 每孔接种2×105个HNE1细胞于完全培养基中， 细胞生长至80% 汇合期， 将重组体DNA和脂质体混合， 加到细胞中培养12 h后， 用Hank溶液洗涤转染中的细胞后， 加入完全培养基继续培养。 细胞转染48 h后， 用选择性培基(G418浓度： 1～3天为250 mg／L， 以后为550 mg／L)培养， 隔天换液， 8～10天左右出现抗性克隆， 14天后挑单个克隆扩大培养， 建成稳定传代的转染细胞系。
1.2.2      阳性克隆RT-PCR鉴定 按《分子克隆手册》操作。
1.2.3      Northern斑点杂交 按《分子克隆手册》操作。
1.2.4      蛋白质抽提与定量 细胞培养至对数生长期， 弃掉培养液， 用胰酶消化， 加入裂解液(8 mol/L urea, 4% CHAPS, 40 mmol/L Tris， 65 mmol/L DTT)， 液氮反复冻融后， 加入RNA酶 (20 g/L) 4 ℃放置15 min、 13 000 r/min、 4 ℃离心30 min, 收集上清液， 样品存放－70 ℃。 蛋白质定量按Ausubel[11]所述的BradFord方法操作。 确保每次样品上样量为500 μg。
1.2.5      第一向固相pH梯度等电聚焦电泳 采用IPGphor等电聚焦系统， 把干胶条置于胶条盒中放置在IPGphor电泳仪上水化（水化液组成为： 8 mol/L尿素， 0.5% CHAPS， 2.8 g/L DTT及痕量溴酚蓝）15～18 h， 水化完毕按500 V ， 1000 V各1 h， 8000 V 5 h等电聚焦。 聚焦结束后取出胶条， 加入平衡液A（8 mol/L尿素、 0.5 mol/L Tris·HCl、 2% SDS、 30% 甘油、 0.1% DTT）振荡平衡15 min， 再换平衡液B(8 mol/L尿素、 0.5 mol/L Tris·HCl、 2% SDS、 30% 甘油、 1.5% 碘乙酰胺 )振荡平衡15 min， 取出胶条滤干， 准备第二向电泳。
1.2.6      第二向SDS-PAGE 按照文献[11]所述的方法进行， 采用分离胶浓度为15% 的不连续SDS-PAGE垂直平板电泳
1.2.7      银染 按银染试剂盒操作手册操作。
1.2.8      图像分析 通过PDQuest 2-D分析软件系统分别比较四次重复结果图谱， 将HNE1和转染BRD7细胞的进行匹配分析， 获得BRD7基因转染所致的蛋白质差异表达变化,将这些蛋白质点在双向电泳凝胶图谱上标出。
1.2.9      蛋白质原位酶解 按Bergman等[12]的方法进行。
1.2.10    MADLI-TOF肽质指纹图分析 (1) 在样品中加入10 μl 0.1% TFA水溶液， 振荡， 使样品充分溶解， 再用美国Millipore公司的10 μl ZipTipTM C18器嘴脱盐。 (2) 质谱分析制备好的样品使用美国bruker公司的ProFlexTM III MADLI-TOF质谱仪进行分析。

 

2 结果（Results）

2.1 pcDNA3.1(+)/BRD7 重组体转染、 克隆筛选与鉴定

       由于BRD7基因在鼻咽癌细胞系HNE1中表达下调， 因此采用脂质体转染技术将含有BRD7基因的真核表达载体导入HNE1细胞中， 建立稳定传代的转染细胞系。 pcDNA3.1(+)/BRD7重组体通过脂质体转染HNE1细胞后， 经G418筛选， 挑选9个pcDNA3.1(+)/BRD7/HNE1重组体转染的抗性克隆扩大培养，建立为稳定的转染细胞系。 为了确定上述转染细胞系BRD7基因的表达， 我们抽提细胞总RNA， 采用RT-PCR 和Northern 斑点杂交方法检测该基因的重表达， 并以GAPDH为内对照。 RT-PCR结果显示7个pcDNA3.1(+)/BRD7/HNE1克隆中2、 3、 5、 6、 7号抗性克隆有较强的325 bp扩增条带(其中6号克隆因污染死亡)， 而未转染的HNE1细胞未见325 bp的明显扩增条带(图1)。 我们进一步将4个阳性克隆做Northern斑点杂交， 杂交结果与RT-PCR相一致， 如图2。

 

Fig.1      Results of RT-PCR

1,HNE1; 2－9,pcDNA3.1(+)/BRD7/HNE1; M,DL2000 marker.

 

Fig.2       Results of blot-spot

(A) 1－4, pcDNA3.1(+)/BRD7/HNE1; 5, HNE1. (B) 1－5, GAPDH.

 

将Northern杂交结果进行灰度扫描， 得出每一个点的灰度值， 最后根据公式算出每一个点的相对强度(表1)， 挑选出相对强度最大1号克隆为实验细胞。

 

Table 1   Analysis of Northern blot-spot

 

BRD7

GAPDH

BRD7/GAPDH1

1

1172

1477

0.793

2

1328

1828

0.7263

3

974

1530

0.6364

4

959

1410

0.6805

5

311

1662

0.187

 

2.2   BRD7基因稳定转染HNE1细胞的二维凝胶电泳图谱制备与分析

分别抽提HNE1、 pcDNA3.1(+)/HNE1 和pcDNA3.1(+)/BRD7/HNE1细胞的总蛋白质， 通过蛋白质定量， 确保每一次上样量为恒定的500 μg。 经第一向固相pH梯度等电聚焦电泳和第二向垂直平板SDS-PAGE， 凝胶银染后获得二维凝胶图并扫描输入计算机。 采用软件分析， 发现银染后二维凝胶图上可识别的蛋白质斑点约有800个， 主要分布在等电点 4.0 到7.5。 将四次重复实验所获得的二维凝胶图进行统计学分析， 结果显示： HNE1、 pcDNA3.1(+)/HNE1和pcDNA3.1(+)/BRD7/HNE1细胞二维图谱的蛋白质点分别为(800±28)、 (800±42)、 (800±37)个。 经上述分析表明， 在BRD7基因过表达后， 90%～95% 的蛋白质表达与对照组一致， 5%～10%的蛋白质为差异表达。 说明BRD7基因的过表达可导致HNE1细胞蛋白质表达谱的改变， 即pcDNA3.1(+)/BRD7/HNE1细胞蛋白质表达谱发生明显的改变。 而pcDNA3.1(+)/HNE1与HNE1蛋白质表达谱较一致， 说明载体本身对蛋白质表达谱影响不大。 通过点对应匹配消除空白载体所致的蛋白质斑点的差异， 在pcDNA3.1(+)/BRD7/HNE1 的双向电泳图中， 10个明显的上调蛋白质点和10个明显下调的蛋白质点被鉴定。 将10个明显的上调蛋白质标记在pcNDA3.1(+)/BRD7/HNE1的双向电泳图中（图3）， 将明显下调10个蛋白质标记在对应的HNE1双向电泳图中(图4)。

 

Fig.3      Identify up-regulated expression proteins

Fig.4      Identify down-regulated expression proteins

 

2.3 差异蛋白质点的质谱分析

将差异表达的蛋白质斑点（双向电泳图中标记）从银染后的二维凝胶中切下， 进行蛋白质胶内原位消化、 酶解后的肽混合物经MALDI-TOF-MS 分析， 获得肽质指纹。 图5是下调蛋白质斑点P D2斑点的肽质指纹图。

 

Fig.5      Down-regulated PD3 protein of PMF

 

2.4 差异蛋白质的鉴定

以标准的蛋白质双向电泳图为参照确定各差异蛋白质的分子量和等电点， 将差异表达蛋白质的肽质谱指纹、 分子量及等电点输入蛋白质数据库并进行搜寻数据库， 被鉴定的差异蛋白质点及相应的分子量和等电点见表2、 表3。

 

Table 2   Up-regulated proteins

Spot

Database searched

Accession number

Match petides

Score

Coverage sequence %

Protein identify

PU1

NCBInr

28878

10

2.01E+04

18%

Argininosuccinate Lyase

PU2

Genpept

6102891

13

2.32E+03

42%

Hypothetical protein

PU4

Genpept

X82321

6

2.97E+03

26%

TSA

PU5

Genpept

U73514

11

1.28E+08

75%

Short-chain alcohol dehy drogenase

PU6

Swissprt

Q14933

5

1.45E+05

41%

UbcH8(Ubiquitin-protein ligase)

PU8

Swissprt

P05387

5

4.77E+03

74%

60 S acidic ribosomal protein p2

PU11

Genpept

10440170

5

2.16E+03

33%

(AK027122)unnamed protein product

PU12

Genpept

307195

9

1.74E+03

27%

Metalloproteinase inhibitor-2 precursor

PU15

Swissprt

Q12798

6

1.56E+03

30%

Centrin 1

PU17

Swissprt

Q9UL46

5

2.98E+03

25%

Proteaseome activator28 beta subunit

 

Table 3   Down-regulated proteinsSpot

Spot

Database searched

Accession number

Match peptides

Score

Coverage sequence %

Protein identify

PD1

Genpept

2627171

6

4.52E+3

23%

Thyroid transcriptional factor-1

PD2

Genpept

L06132

9

4.17E+06

47%

Voltage-dependent anion channel

PD3

Genpept

BC0094905

9

1.40E+06

44%

Adenylate kinase

PD5

Swissprt

Q9HCS2

10

1.96E+03

31%

Cytochrome P450 4F12

PD7

NCBInr

21685562

7

1.83E+03

33%

SREC—4

PD8

Swissprt

P51946

6

1.18E+03

30%

CyclinH(mo15-associated protein)

PD9

Swissprt

P09486

7

5.78E+03

24%

SPARC preursor

PD10

NCBInr

AF060225

9

3.01E+03

26%

My012 protein

PD11

Swissprt

Q9Y224

7

9.08E+03

34%

Hypothetical protein CGI-99

PD14

Swissprt

Q060259

7

1.04E+05

37%

Neuropsin precursor (NP)

 

3     讨论(Discussion)

研究表明， HNE1细胞在转染BRD7基因后， 蛋白质表达谱发生了改变， 我们鉴定出10个表达明显上调的蛋白质点： 精氨酸代琥珀酸裂解酶（argininosuccinate Lyase）、 假定蛋白（hypothetical protein）、 含硫的特异性抗氧化蛋白（thio-specific antioxdant， TSA）、 短链乙醇脱氢酶（short-chain alcohol dehydrogenase）、 泛蛋白连接蛋白(ubiquitin-protein ligase， UbcH8)、 酸性核糖体蛋白2（60 S acidic ribosomal protein p2）、 未命名蛋白（unnamed protein product）、 金属蛋白酶抑制因子2前体（metalloproteinase inhibitor-2 precursor）、 中心体蛋白1（centrin 1）、 蛋白酶体激活因子28的β亚单位（Proteaseome activator28 β subunit）。 其中精氨酸代琥珀酸裂解酶， 是精氨酸代谢中的关键酶之一。 而某些肿瘤如肝癌， 黑色素瘤显示出精氨酸缺乏， 提高这些肿瘤中精氨酸的含量有助于恶性表型的部分逆转[13]。 另外， 张必成等通过cDNA基因芯片研究显示精氨酸代琥珀酸裂解酶在HNE1细胞中呈低表达。 含硫的特异性抗氧化蛋白质是一类抗氧化蛋白质， 一般认为抗氧化蛋白质在保护细胞， 维持细胞正常功能中有着重要的作用， 有文献报道抗氧化蛋白质能部分的抑制蛋白激酶C的活性[14]。 金属蛋白酶抑制因子2是一类很重要的调节因子， 它能下调诸如VEGF、 TKR-生长因子从而影响肿瘤的生长、 侵袭和转移[15～17]。 MHC分子作为代表个体特异性的主要组织抗原， 在机体的免疫排斥反应中起着重要的作用， 它参与抗原的处理及T细胞、 B细胞限制性识别抗原， 以及参与对免疫应答的遗传控制。 许多人类肿瘤或肿瘤细胞株的MHC-1类抗原表达缺失或表达量降低， 这就可能是Tc细胞不能识别并对肿瘤细胞发起攻击， 从而导致肿瘤细胞逃逸。 蛋白酶体激活因子28的β亚单位是一个与MHC-1类抗原递呈有关的蛋白， 有资料显示它能选择性的提高病毒MHC-1抗原的递呈[18]。 另外， PA28的表达在许多肿瘤细胞中下调[18～20]。

同时， 我们还鉴定出个明显下调的蛋白质： 甲状腺转录因子1（thyroid transcriptional factor-1）、 电压依赖性阴离子通道蛋白（voltage-dependent anion channel）、 腺苷酸激酶（adenylate kinase）、 细胞色素P450 4F12（cytochrome P450 4F12）、 内皮细胞清道夫受体2（scavenger receptor expressed by endothelial cells-2, SREC-2）、 细胞周期蛋白H(cyclinH, MO15-associated protein)、 酸性富含半胱氨酸分泌性蛋白前体（secreted protein acidic and rich in cys-teine precursor， SPARC precursor）、 my012 protein， 假设蛋白CGI-99（hypothetical protein CGI-99）、 神经丝氨酸蛋白酶前体neuropsin precursor。 其中， 甲状腺转录因子1是在多种肺癌细胞系中高表达， 特别是在腺癌和小细胞肺癌[21]。 有人将甲状腺转录因子1作为一种诊断肝癌(hepatocellular carcinoma， HCC)的分子标志[22,23]。 电压依赖性阴离子通道蛋白是线粒体外膜上一类通道蛋白， 它参与对钙离子的调控[24]。 腺苷酸激酶是维持AMP、 ADP与ATP平衡， 从而参与能量代谢。 细胞色素P450是体内一种重要的混合功能氧化酶系统， 它是外源性化学物质在体内进行生物转化的最主要的代谢酶， 该酶系统对于化学致癌物的代谢具有两重性。 目前认为细胞色素P450基因的多态性是肿瘤易感性的一个重要方面， 而对于细胞色素P450基因的多态性与肿瘤的关系的研究也已逐渐成为肿瘤分子流行病学研究的热点。 细胞色素P450 4F12是2001年克隆到的该家族一个新的成员[25， 26]， 具体功能还在研究中。 SREC-2含有一个EGF样的细胞外结构域[27]。 CDK激活性蛋白激酶（CDK activating kinase, CAK）是由多个亚单位组成的蛋白激酶， 其催化单位是高度保守的CDK相关蛋白激酶MO15(CDK7)， 另外一个主要的亚单位是不大为人所知的细胞周期蛋白H， 当CDK7与CyclinH结合后， 不仅可以使CDC2和CDK2磷酸化， 而且能使CDK4磷酸化， 从而导致细胞周期调控中主要的CDK-Cyclin底物磷酸化而激活[28， 29]。 虽然由CAK导致的CDK-Cyclin底物磷酸化与Cyclin的时相性一致， 然而CDK-Cyclin底物磷酸化的变化似乎并不随CAK的活性变化而改变， 这表明CAK在某些生长条件下的调控极为重要， 但可能不是细胞周期变化中的限速关键步骤。 SPARC是一种在肿瘤组织高表达， 并且它的表达与肿瘤的恶性程度， 肿瘤的侵袭、 转移有关[20， 30]。 Neuropsin是丝氨酸蛋白激酶家族的新成员， 首先是从高表达的卵巢癌中克隆得到的[31， 32]。 对与丝氨酸蛋白激酶家族其它家族成员研究表明， 丝氨酸蛋白激酶有着促进细胞增殖的作用。

通过以上分析可以看出， BRD7基因的过表达能够影响鼻咽癌细胞株HNE1的蛋白质表达谱， 这种影响表现在BRD7过表达后的差异蛋白质点上， 这也正是BRD7基因的功能体现之所在。 这些差异蛋白质涉及基因表达调控、 细胞周期的调控分子、 细胞免役， 细胞代谢等众多事件， 说明BRD7作为一个重要的抑瘤基因候选者可能直接或间接作用于细胞内外的各个环节。

此外， 还有很多问题值得进一步思考与解决。 对于基因转染， 我们采用的是脂质体介导的转染方法， 虽然该方法在当前是被普遍采用的， 但该方法存在一个主要问题， 即该方法介导的基因转染是随机插入， 无法控制目的基因插入到细胞基因组中的位置， 从而无法判断某些生物学效应是由于转染基因本身产生的， 还是由于插入的位置所造成的。 为了解决这一问题， 有必要将其他的阳性克隆进行重复实验， 从而避免因目的基因随机插入而产生的位置效应。 另外， 对于这些通过质谱鉴定出的差异点， 我们还有必要进行RT-PCR、 Western印迹方法做进一步的验证。

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Received: April 2, 2003  Accepted: June 13, 2003

This work was supported by grants from the National High technology Research and Development Program of China (863 program)(No.2001AA 221031) and the National Natural Science Foundation of China (No. 30271403， No. 30100105)

*Corresponding author: Tel， 86-731-4805383； e-mail， [email protected]